Ejemplos: ADN recombinante y Ácidos nucleicos recombinantes

1. Eritropoyetina recombinante humana (rHuEPO) en la anemia de enfermedad renal crónica

• T: Tema

La eritropoyetina recombinante humana (rHuEPO) es una proteína terapéutica producida mediante tecnología de ADN recombinante, utilizada desde finales de los años 80 para tratar la anemia asociada a la enfermedad renal crónica (ERC). Es uno de los primeros y más exitosos productos biofarmacéuticos obtenidos por ingeniería genética.

• O: Objetivos

El objetivo principal de esta tecnología es producir eritropoyetina funcional en células cultivadas in vitro, que pueda administrarse a pacientes con ERC, en quienes la producción endógena de esta hormona es insuficiente. Con ello, se busca mejorar los niveles de hemoglobina, reducir la necesidad de transfusiones y aumentar el hematocrito, mejorando la oxigenación y calidad de vida del paciente. 

• G: Gen o secuencia a clonar

Se clona el gen humano EPO, que codifica la eritropoyetina. Este gen se optimiza eliminando intrones innecesarios y se incluye una secuencia señal de secreción, para que la proteína producida sea exportada fuera de la célula hospedadora al medio de cultivo.

Gen EPO humano: ~5,4 kb genómico; cDNA para rHuEPO (sin intrones + señal de secreción): ~0,6–0,9 kb (~600–900 pb) usado en vectores de expresión para tratar la anemia en enfermedad renal crónica.

• ER: Enzimas de restricción

Para insertar el gen EPO en un vector de expresión, se utilizan enzimas de restricción como EcoRI, BamHI o HindIII, que cortan el ADN en sitios específicos del vector y del fragmento génico, generando extremos cohesivos compatibles.

• EL: Enzima Ligasa  

Una vez digerido el vector y el gen, se utiliza ADN ligasa T4, que cataliza la unión entre los extremos cohesivos del vector y del gen EPO, generando una molécula de ADN recombinante funcional.

•  V: Vector

El vector de expresión es un plásmido eucariota (por ejemplo, pcDNA3) que contiene un promotor fuerte (como CMV), una señal de secreción, una región poli-A para terminación, y un gen de resistencia a antibióticos (como neomicina) para la selección de células transfectadas.

• CR: Célula receptora

Las células receptoras utilizadas son CHO son eucariotas (células de ovario de hámster chino), ampliamente empleadas en biotecnología por su capacidad para realizar modificaciones postraduccionales humanas, especialmente glicosilación, crucial para la actividad funcional de la eritropoyetina.

• #MTG: Mecanismo de transferencia del gen 

El vector recombinante se introduce en las células CHO mediante transfección, usando métodos como electroporación o lipofección, que permiten la entrada eficiente del ADN al núcleo celular.

1. Se construye un vector con el cDNA de EPO (0,6–0,9 kb) y señal de secreción bajo un promotor fuerte.
2. El vector se introduce en células CHO mediante electroporación o lipofección.
3. El ADN llega al núcleo y se integra o mantiene episomalmente.
4. Se seleccionan clones estables con antibióticos o sistema GS/MTX.
5. Las células expresan y secretan rHuEPO glicosilada al medio de cultivo.

• MIC: Métodos de identificación de clones

Tras la transfección, se aplica una selección antibiótica (usualmente con G418), de modo que solo las células que han incorporado el vector sobrevivan. Luego se realizan PCR y secuenciación para confirmar la inserción correcta del gen. Finalmente, se evalúa la expresión de la proteína por ELISA o Western blot, y se realizan bioensayos funcionales para comprobar su actividad eritropoyética.

Una vez identificadas las células productoras, estas se cultivan a gran escala en biorreactores, donde secretan rHuEPO al medio. El sobrenadante es recolectado y purificado mediante técnicas de cromatografía de afinidad e intercambio iónico, hasta obtener una proteína recombinante con pureza farmacéutica.

En pacientes con ERC, el tratamiento con rHuEPO logra aumentar los niveles de hemoglobina (hasta +3 g/dL), reducir la necesidad de transfusiones, y mejorar el estado general del paciente. Sin embargo, se ha documentado un riesgo de hipertensión y eventos trombóticos en aproximadamente 22–44 % de los pacientes, especialmente con dosis altas o condiciones cardiovasculares previas, por lo que se requiere monitoreo clínico constante.

Imagen obtenida de: https://images.app.goo.gl/Y84vvWdZ9tBrW6vTA

Video Obtenido de: https://youtu.be/wRePYfZko54?si=QBtCnrSiITVMuCrY

Referencias Bibliográficas

1. García López FJ, García López FJ. La eritropoyetina recombinante humana en la enfermedad renal crónica: lecciones que aprender. Nefrología (Madr). 2011;2(Suplemento 4):7. doi:10.3265/NefrologiaSuplementoExtraordinario.pre2011.Jul.11056. Disponible en: https://www.revistanefrologia.com/es-la-eritropoyetina-recombinante-humana-enfermedad-renal-cronica-lecciones-que-aprender-articulo-X2013757511000010?utm_source=chatgpt.com
2. Reza‑Zaldívara E, Sandoval‑Avila S, Gutiérrez‑Mercado YK, Vázquez‑Méndez E, Canales‑Aguirre AA, Esquivel‑Solís H, et al.
   La eritropoyetina humana recombinante reduce la disfunción sensoriomotora y el deterioro cognitivo en ratas con enfermedad renal crónica. Neurología. 2017;? (acceso online).
   Disponible en: https://www.elsevier.es/es-revista-neurologia-295-articulo-la-eritropoyetina-humana-recombinante-reduce-S0213485317302761
3. Remonti M, et al. La eritropoyetina humana recombinante reduce la disfunción renal y corrige la anemia en ratas con enfermedad renal crónica. Rev Nefrol. 2017;∼7(1):[páginas]. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0213485317302761.

Evidencia: 

2. Ácidos nucleicos recombinantes naturales: Retrotransposones LINE‑1 (L1)

T: Tema
Los retrotransposones LINE‑1 (Long Interspersed Nuclear Elements‑1) son elementos genéticos móviles que se comportan como ácidos nucleicos recombinantes de forma natural, ya que pueden copiarse e insertarse en nuevas ubicaciones del genoma sin intervención humana. Representan el único retrotransposón autónomo y activo en el genoma humano.

O: Objetivos

La función de LINE‑1 no responde a una finalidad “intencional” como en la ingeniería genética, pero desde el punto de vista biológico, estos elementos generan variabilidad genética, mutaciones estructurales, nuevas combinaciones génicas y en algunos casos contribuyen a la evolución de genes funcionales.

G: Gen o secuencia a clonar

Un LINE‑1 funcional tiene aproximadamente 6 kb y contiene:

• Una región 5′UTR promotora,

• Dos marcos de lectura abiertos: ORF1 (codifica una proteína de unión a ARN) y ORF2 (codifica una transcriptasa inversa y una endonucleasa),

• Una 3′UTR con cola poli-A y sitios de duplicación en la integración.

Aunque hay más de 500,000 copias de L1 en el genoma humano, solo entre 80 y 100 están intactas y pueden retrotransponerse activamente.

ER: Enzimas de restricción
No participan enzimas de restricción externas. En su lugar, la proteína ORF2p actúa como endonucleasa, cortando el ADN genómico en un sitio diana con la secuencia TT‑TT/A para iniciar el proceso de inserción.

EL: Enzima ligasa

Tampoco se requiere una ligasa externa. En el proceso natural de inserción, el ADN recién retrotranscrito se integra mediante mecanismos celulares de reparación del ADN, que sellan la nueva copia en el genoma.

V: Vector
El ARN L1 actúa como su propio vector, ya que se traduce en proteínas (ORF1p y ORF2p) que se unen en cis al mismo ARN que los codificó, formando una partícula ribonucleoproteica (RNP) que sirve de vehículo autorreplicante.

CR: Célula receptora
La célula huésped es cualquier célula somática o germinal humana o de otros mamíferos, es decir, células eucariotas. La retrotransposición puede ocurrir en el desarrollo temprano, durante la gametogénesis o en células tumorales, entre otras.

 #MTG: Mecanismo de transferencia o inserción del gen
La inserción se da por un proceso llamado TPRT (Target-Primed Reverse Transcription):

1. El RNP entra al núcleo.

2. ORF2p corta el ADN genómico.

3. Se sintetiza ADN a partir del ARN L1 directamente en el sitio de inserción.

4. El ADN complementario se integra, generando duplicaciones del sitio diana (TSD) y comúnmente truncamientos en el extremo 5′ de la nueva copia.

MIC: Métodos de identificación de clones
En investigación, los eventos de retrotransposición se detectan mediante:

• PCR de inserción específica,

• Secuenciación del genoma completo,

• Mapeo de inserciones L1 recientes,

• Detección de duplicaciones del sitio diana (TSD),

• Análisis de ARN mensajero de ORF1 y ORF2,

• Ensayos celulares con reporteros (e.g., L1‑EGFP) para medir actividad retrotranspositiva.

Video obtenido de: https://youtu.be/tgXk936c-9Y?si=s9Vzpm06uUxtbJLW

Referencias Bibliográficas

1. Hancks DC, Kazazian HH Jr. Roles for retrotransposon insertions in human disease. Mobile DNA. 2016;7:9. doi:10.1186/s13100‑016‑0065‑9. Disponible en: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC3376660/
2. Capra JA, Hubisz MJ, Kostka D, Pollard KS, Siepel A. Análisis basado en modelo de la conversión génica sesgada hacia GC en los genomas humano y chimpancé [traducción del título original]. arXiv preprint arXiv:1303.2170. 2013. Disponible en: https://arxiv.org/abs/1303.2170.
3. Kazazian HH Jr, Goodier JL. Active human retrotransposons: variation and disease. Hum Genet. 2005;117(6):411‑27. doi:10.1007/s00439‑005‑1265‑2. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3376660/. 

Evidencia: