1. Eritropoyetina recombinante humana (rHuEPO) en la anemia de enfermedad renal crónica
La eritropoyetina recombinante humana (rHuEPO) es una proteína terapéutica producida mediante tecnología de ADN recombinante, utilizada desde finales de los años 80 para tratar la
anemia asociada a la enfermedad renal crónica (ERC). Es uno de los primeros y más exitosos productos biofarmacéuticos obtenidos por ingeniería genética.
El objetivo principal de esta tecnología es
producir eritropoyetina funcional en células cultivadas in vitro, que pueda administrarse a pacientes con ERC, en quienes la producción endógena de esta hormona es insuficiente. Con ello, se busca mejorar los niveles de hemoglobina, reducir la necesidad de transfusiones y aumentar el hematocrito, mejorando la oxigenación y calidad de vida del paciente.
- G: Gen o secuencia a clonar
Se clona el
gen humano EPO, que codifica la eritropoyetina. Este gen se optimiza eliminando intrones innecesarios y se incluye una
secuencia señal de secreción, para que la proteína producida sea exportada fuera de la célula hospedadora al medio de cultivo.
Gen
EPO humano: ~5,4 kb genómico;
cDNA para rHuEPO (sin intrones + señal de secreción): ~0,6–0,9 kb (~600–900 pb) usado en vectores de expresión para tratar la anemia en enfermedad renal crónica.
Para insertar el gen EPO en un vector de expresión, se utilizan
enzimas de restricción como
EcoRI,
BamHI o
HindIII, que cortan el ADN en sitios específicos del vector y del fragmento génico, generando extremos cohesivos compatibles.
Una vez digerido el vector y el gen, se utiliza
ADN ligasa T4, que cataliza la unión entre los extremos cohesivos del vector y del gen EPO, generando una molécula de ADN recombinante funcional.
El
vector de expresión es un plásmido eucariota (por ejemplo,
pcDNA3) que contiene un
promotor fuerte (como CMV), una señal de secreción, una región poli-A para terminación, y un gen de resistencia a antibióticos (como
neomicina) para la selección de células transfectadas.
Las
células receptoras utilizadas son
CHO son eucariotas (células de ovario de hámster chino), ampliamente empleadas en biotecnología por su capacidad para realizar modificaciones postraduccionales humanas, especialmente
glicosilación, crucial para la actividad funcional de la eritropoyetina.
El vector recombinante se introduce en las células CHO mediante
transfección, usando métodos como
electroporación o
lipofección, que permiten la entrada eficiente del ADN al núcleo celular.
- Se construye un vector con el cDNA de EPO (0,6–0,9 kb) y señal de secreción bajo un promotor fuerte.
- El vector se introduce en células CHO mediante electroporación o lipofección.
- El ADN llega al núcleo y se integra o mantiene episomalmente.
- Se seleccionan clones estables con antibióticos o sistema GS/MTX.
- Las células expresan y secretan rHuEPO glicosilada al medio de cultivo.
- MIC: Métodos de identificación de clones
Tras la transfección, se aplica una selección antibiótica (usualmente con G418), de modo que solo las células que han incorporado el vector sobrevivan. Luego se realizan PCR y secuenciación para confirmar la inserción correcta del gen. Finalmente, se evalúa la expresión de la proteína por ELISA o Western blot, y se realizan bioensayos funcionales para comprobar su actividad eritropoyética.
Una vez identificadas las células productoras, estas se cultivan a gran escala en biorreactores, donde secretan rHuEPO al medio. El sobrenadante es recolectado y purificado mediante técnicas de cromatografía de afinidad e intercambio iónico, hasta obtener una proteína recombinante con pureza farmacéutica.
En pacientes con ERC, el tratamiento con rHuEPO logra aumentar los niveles de hemoglobina (hasta +3 g/dL), reducir la necesidad de transfusiones, y mejorar el estado general del paciente. Sin embargo, se ha documentado un riesgo de hipertensión y eventos trombóticos en aproximadamente 22–44 % de los pacientes, especialmente con dosis altas o condiciones cardiovasculares previas, por lo que se requiere monitoreo clínico constante.
Referencias Bibliográficas
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- Reza‑Zaldívara E, Sandoval‑Avila S, Gutiérrez‑Mercado YK, Vázquez‑Méndez E, Canales‑Aguirre AA, Esquivel‑Solís H, et al.
La eritropoyetina humana recombinante reduce la disfunción sensoriomotora y el deterioro cognitivo en ratas con enfermedad renal crónica. Neurología. 2017;? (acceso online).
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Evidencia:
2. Ácidos nucleicos recombinantes naturales: Retrotransposones LINE‑1 (L1)
T: Tema
Los retrotransposones LINE‑1 (Long Interspersed Nuclear Elements‑1) son elementos genéticos móviles que se comportan como ácidos nucleicos recombinantes de forma natural, ya que pueden copiarse e insertarse en nuevas ubicaciones del genoma sin intervención humana. Representan el único retrotransposón autónomo y activo en el genoma humano.
O: Objetivos
La función de LINE‑1 no responde a una finalidad “intencional” como en la ingeniería genética, pero desde el punto de vista biológico, estos elementos generan variabilidad genética, mutaciones estructurales, nuevas combinaciones génicas y en algunos casos contribuyen a la evolución de genes funcionales.
G: Gen o secuencia a clonar
Un LINE‑1 funcional tiene aproximadamente 6 kb y contiene:
Una región 5′UTR promotora,
-
Dos marcos de lectura abiertos: ORF1 (codifica una proteína de unión a ARN) y ORF2 (codifica una transcriptasa inversa y una endonucleasa),
-
Una 3′UTR con cola poli-A y sitios de duplicación en la integración.
Aunque hay más de 500,000 copias de L1 en el genoma humano, solo entre 80 y 100 están intactas y pueden retrotransponerse activamente.
ER: Enzimas de restricción
No participan enzimas de restricción externas. En su lugar, la proteína ORF2p actúa como endonucleasa, cortando el ADN genómico en un sitio diana con la secuencia TT‑TT/A para iniciar el proceso de inserción.
EL: Enzima ligasa
Referencias Bibliográficas
- Hancks DC, Kazazian HH Jr. Roles for retrotransposon insertions in human disease. Mobile DNA. 2016;7:9. doi:10.1186/s13100‑016‑0065‑9. Disponible en: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC3376660/
- Capra JA, Hubisz MJ, Kostka D, Pollard KS, Siepel A. Análisis basado en modelo de la conversión génica sesgada hacia GC en los genomas humano y chimpancé [traducción del título original]. arXiv preprint arXiv:1303.2170. 2013. Disponible en: https://arxiv.org/abs/1303.2170.
- Kazazian HH Jr, Goodier JL. Active human retrotransposons: variation and disease. Hum Genet. 2005;117(6):411‑27. doi:10.1007/s00439‑005‑1265‑2. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3376660/.
Evidencia:
